polia polimeraza v pripravkih za sekvenciranje naslednje generacije (ngs)

polia polimeraza(PAP) je ključna encimska aktivnost, ki je odgovorna za dodajanje poli-A repa na 3’ konec RNA molekul. Ta aktivnost ima pomembno vlogo pri splošni stabilnosti, transportu in prevajanju RNA. V okviru NGS pa PAP omogoča dodajanje A oligo RNA vzorcem pred sekvenciranjem, tako da lahko pridobimo podatke visoke kakovosti iz različnih RNA virov.

Pomembnost dodajanja poli A repa

Obstaja veliko prednosti, povezanih z vključitvijo poli A repa v mRNA. Najprej, A rep pomaga pri izboljšanju stabilnosti RNA molekul proti ribonukleazni aktivnosti eksonukleaz. Drugič, poli A rep ima vlogo pri začetku prevajanja s spodbujanjem vezave ribosoma na mRNA. V primeru NGS pripravkov se lahko mRNA s poli A repom enostavno uporablja za bolj osredotočeno analizo izražanja genov skupaj z variacijami transkriptov, saj jih je mogoče specifično obogatiti.

Priprava vzorcev NGS

Delovni postopki NGS vključujejo pripravo RNA vzorcev, ki obsegajo naslednje korake: reverzno transkripcijo, konstrukcijo cDNA in amplifikacijo. Prav tako je običajno dodati polimerazo Poly A med sintezo cDNA, da se v končne cDNA molekule vključi poli-A rep. Ta sprememba je ključna za amplifikacijo in sekvenciranje knjižnic, saj povečuje učinkovitost korakov, vključenih v pripravo knjižnic.

Uporabe v RNA-Seq

PAP je prav tako zelo koristen pri aplikacijah sekvenciranja RNA (RNA-Seq), ker omogoča bolj učinkovito obogatitev za poli A-rep mRNA. To pomaga pri zajemanju jasnejše slike transkriptoma organizma, ki ga preučujemo. Tako lahko takšno izboljšanje pomaga pri določanju diferencialno izraženih genov, alternativnih splicing dogodkov ali celo nekodirajočih RNA. Poleg tega vključitev PAP v NGS priprave omogoča pridobitev obetavnejših podatkov.

Dodajanje PAP v NGS pripravkih lahko močno izboljša kakovost in natančnost podatkov o sekvenciranju. Kar je še pomembneje, ko se raziskave nadaljujejo, bo pomen PAP za omogočanje znanstvenikom, da preučujejo transkriptom, ostal pomemben.