polipolimerază în preparate de secvențiere de generație următoare (ngs)

polipolimerază(PAP) este o acțiune enzimatică cheie care este responsabilă pentru adăugarea cozii poli-A la capătul 3’ al moleculelor de ARN. Această activitate are un rol semnificativ în stabilitatea generală, transportul și traducerea ARN-ului. În cadrul NGS, totuși, PAP permite adăugarea oligo A la probele de ARN înainte de secvențiere, astfel încât date de înaltă calitate din diverse surse de ARN pot fi obținute.

Semnificația adăugării cozii poli A

Există multe avantaje asociate cu încorporarea cozii poli A în mARN. În primul rând, coada A ajută la îmbunătățirea stabilității moleculelor de ARN împotriva activității ribonucleazei de către exonucleaze. În al doilea rând, coada poli A are un rol de jucat în inițierea traducerii prin promovarea atașării ribozomului la mARN. În cazul pregătirilor NGS, mARN cu coadă poli A poate fi utilizat cu ușurință pentru o analiză mai concentrată a expresiei genice împreună cu variațiile transcriptului, deoarece acestea pot fi îmbogățite specific.

Pregătirea probelor NGS

Fluxurile de lucru NGS includ pregătirea probelor de ARN care implică următorii pași: transcripție inversă, construcția CDNA și amplificare. De asemenea, este comun să se adauge polimeraza Poly A în timpul sintezei CDNA pentru a include un coadă poly-A în moleculele finale de cDNA. Această modificare este critică pentru amplificarea bibliotecii și secvențiere, deoarece crește eficiența pașilor implicați în pregătirea bibliotecilor.

Aplicații în RNA-Seq

PAP este de asemenea foarte util în aplicațiile de secvențiere ARN (RNA-Seq) deoarece permite o îmbogățire mai eficientă pentru mARN cu coadă poly A. Acest lucru ajută la capturarea unei imagini mai clare la nivelul transcriptomului al organismului studiat. Astfel, o astfel de îmbunătățire poate ajuta la determinarea genelor exprimate diferențial, a evenimentelor de splicing alternativ sau chiar a ARN-urilor non-codante. În plus, includerea PAP în pregătirile NGS permite obținerea unor date mai promițătoare.

Adăugarea PAP în pregătirile NGS poate îmbunătăți semnificativ calitatea și acuratețea datelor de secvențiere. Ceea ce este și mai important, pe măsură ce cercetarea continuă să progreseze, importanța PAP pentru a permite oamenilor de știință să investigheze transcriptomul va rămâne majoră.