polipolimerazy w preparatach sekwencjonowania (ngs) nowej generacji

polipolimerazy(PAP) jest kluczowym działaniem enzymatycznym, które odpowiada za dodawanie ogona poli-A do końca 3’ cząsteczek RNA. Ta aktywność odgrywa znaczącą rolę w ogólnej stabilności, transporcie i translacji RNA. W ramach NGS, jednakże, PAP umożliwia dodanie oligo A do próbek RNA przed sekwencjonowaniem, aby dane wysokiej jakości z różnych źródeł RNA mogły być pozyskiwane.

Znaczenie dodawania ogona poli A

Istnieje wiele zalet związanych z włączeniem ogona poli A do mRNA. Przede wszystkim, ogon A wspomaga zwiększenie stabilności cząsteczek RNA wobec aktywności rybonukleazy przez egzonukleazy. Po drugie, ogon poli A odgrywa rolę w inicjacji translacji poprzez promowanie przyczepności rybosomu do mRNA. W przypadku przygotowań NGS, mRNA z ogonem poli A może być łatwo używane do bardziej ukierunkowanej analizy ekspresji genów wraz z wariacjami transkryptów, ponieważ mogą być one specyficznie wzbogacane.

Przygotowanie próbek NGS

Przepływy pracy NGS obejmują przygotowanie próbek RNA, które obejmują następujące kroki: odwrotna transkrypcja, konstrukcja cDNA i amplifikacja. Zwykle dodaje się również polimerazę poli A podczas syntezy cDNA, aby uwzględnić ogon poli-A w końcowych cząsteczkach cDNA. Ta modyfikacja jest kluczowa dla amplifikacji biblioteki i sekwencjonowania, ponieważ zwiększa efektywność kroków związanych z przygotowaniem bibliotek.

Zastosowania w RNA-Seq

PAP jest również bardzo przydatny w aplikacjach sekwencjonowania RNA (RNA-Seq), ponieważ pozwala na bardziej efektywne wzbogacenie mRNA z ogonem poli A. Pomaga to w uchwyceniu jaśniejszego obrazu transkryptomu organizmu będącego przedmiotem badań. Tak więc, takie ulepszenie może pomóc w określeniu genów różnicowo wyrażanych, zdarzeń alternatywnego splicingu, a nawet RNA niekodujących. Ponadto, uwzględnienie PAP w przygotowaniach NGS umożliwia uzyskanie bardziej obiecujących danych.

Dodanie PAP w przygotowaniach NGS może znacznie poprawić jakość i dokładność danych sekwencjonowania. Co ważniejsze, w miarę postępu badań, znaczenie PAP dla umożliwienia naukowcom badania transkryptomu pozostanie istotne.