poly-a-polymerasen in preparaten voor volgende generatie sequentie (ngs)

poly-a-polymerase(PAP) is een belangrijke enzymatische actie die verantwoordelijk is voor het toevoegen van de poly-A staart aan de 3' uiteinde van RNA-moleculen. Deze activiteit speelt een significante rol in de algehele stabiliteit, transport en translatie van RNA. Binnen het kader van NGS stelt PAP echter de toevoeging van de A oligo aan de RNA-monsters mogelijk vóór sequencing, zodat gegevens van hoge kwaliteit uit verschillende RNA-bronnen kunnen worden verkregen.

De betekenis van het toevoegen van poly A tailing

Er zijn veel voordelen verbonden aan de incorporatie van poly A staart aan mRNA. Ten eerste helpt een staart bij het verbeteren van de stabiliteit van RNA-moleculen tegen ribonuclease-activiteit door exonucleases. Ten tweede speelt de poly A staart een rol bij de initiatie van translatie door de bevordering van ribosoomhechting aan het mRNA. In het geval van NGS-preparaties kan poly A-gestaart mRNA gemakkelijk worden gebruikt voor meer gerichte genexpressie-analyse samen met transcriptvariaties, aangezien ze specifiek kunnen worden verrijkt.

 NGS Monster voorbereiding

De NGS-workflows omvatten de voorbereiding van de RNA-monsters die de volgende stappen omvatten: reverse transcriptie, cDNA-constructie en amplificatie. Het is ook gebruikelijk om Poly A polymerase toe te voegen tijdens de cDNA-synthese om een poly-A staart in de uiteindelijke cDNA-moleculen op te nemen. Deze wijziging is cruciaal voor bibliotheekamplificatie en sequencing, aangezien het de efficiëntie van de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van de bibliotheken verhoogt.

Toepassingen in RNA-Seq

PAP is ook zeer nuttig in RNA-sequencing (RNA-Seq) toepassingen omdat het een efficiëntere verrijking voor poly A-tailed mRNA mogelijk maakt. Dit helpt bij het vastleggen van een duidelijker transcriptome-niveau beeld van de bestudeerde organismen. Dergelijke verbeteringen kunnen helpen bij het bepalen van differentieel tot expressie gebrachte genen, alternatieve splicing-gebeurtenissen of zelfs niet-coderende RNA's. Bovendien stelt het opnemen van PAP in NGS-voorbereidingen in staat om veelbelovendere gegevens te verkrijgen.

Het toevoegen van PAP in NGS-preparaten kan de kwaliteit en nauwkeurigheid van de sequenceringsgegevens aanzienlijk verbeteren. Wat nog belangrijker is, naarmate het onderzoek blijft vorderen, zal het belang van PAP voor het mogelijk maken van wetenschappers om het transcriptoom te onderzoeken groot blijven.