Ir- Rwol ta " M-Mlv Reverse Transcriptase fis- Sinteżi ta " l- DNA

m-mlv transkriptażi inversa huwa enzim popolari fl-bioloġija molekulari li jagħmel transkizzjoni tal-RNA għal DNA komplementarja (cDNA) u jinkludi minn virus Moloney Murine Leukemia. Huwa enzim essenzjali għall-kloning u sekwenċjar tal-ġeni, u jkollha wkoll użu fil-istudji tal-espressjoni tal-ġeni. L-ikkultar ta' kif jista' dan l-enzim jiġri u jkollha użu jgħidna l-intendiment tal-prattikijiet attwali tal-bioteċnoloġija tagħti.

Applikazzjonijiet fl-Bioloġija Molekulari

Ħadd minn iż-żiemelijiet li jkunu l-aħħar użu tal-M-MLV Reverse Transcriptase huwa fil-kamp tal-istudji tal-espressjoni tal-ġinji. Tista' tigri biċ-ċevrizzjoni retru ta' mRNA li hi mRNA inkonvertibbli għal cDNA, li tirpermi l-estimazzjoni tal-nivelji tal-espressjoni tal-ġinji tridu qPCR (qPCR). Ammin, dawn il-enzimi huma neċessarji fl-kloning li jagħmlu l-inċorpurazzjoni ta' naqsa ta' cDNA tal-ġinji miżjudi f'mikroplazmidi vettori għall-inkrementu fid-batterji jew fit-tnin organiżmi viventi. L-utulizzjarju tagħhom tara ukoll fil-ħdax ta' librijiet ta' cDNA, li huma sistemi ta' molekuli inkawwaċċjati ta' cDNA li jrappruża l-sekwenza magħqufa tal-genom.

Avvanzati u Limitazzjonijiet

L-enzima M-MLV Reverse Transcriptase għandha xi avantatži, minn huma l-ġdid li tibgħad processivity u fideltà alta, li huma desiderabili fit-tħija tal-molekuli cDNA twila. Komplimentarjament, għandha xi difftikultajiet, inklużivament il-gradi ta 'strutture presenti fl-immodella RNA li jistgħu jafossu l-enzima. Dawn il-fattori jistgħu jagħmlu effett negattiv fuq is-sintesi tal-cDNA mill-punt tal-vista prattiku u kwalità. Però, ikkondizzjonijiet tar-reazzjoni għandhom jiġru optimizzati biex jimgħudu fi żviluppar fidissitabbiltà tal-riżultati.

Tehniki u Protokoll

Biex tuża b'mod effettiv l-M-MLV Reverse Transcriptase, għandu jsir attenzjoni speċjali għall-fatturi bħall-għażla ta' primers, it-temperatura tal-reazzjoni u l-kompożizzjoni tal-buffer fost oħrajn. Il-primers għandhom ikunu konstruwiti b'tali mod li ma jkunx hemm loops ta' hairpin u li l-bonding mal-template tal-RNA jkun massimizzat. Meqjusa bħala ottimali għal reazzjoni ta' enzimi, 42°C hija temperatura li hija komuni għal dawn ir-reazzjonijiet sabiex l-attività u l-istabbiltà tal-enzimi jkunu ottimali. Min-naħa l-oħra, l-użu ta' sustanzi oħra bħal Inhibitorijiet ta' Rnase jista' wkoll iżomm l-RNA li jista' jiġi degradat matul ir-reazzjoni.

Perspetivi Futuri

L-avveniment ipprovvjat tal-bioteknoloġija jista' jogħġbok n-nies li jagħmlu oħloq fit-tużom tal-M-MLV Reverse Transcriptase. Strategiji ġdidi disponibbli issa jinkludi l-konstruzzjoni tal-enzimi modifika minn inġinieri mal-proċeduri desiderabbli li kienu prodotti. Ikollha, dawn it-teknoloġija tista' tkun kombinati mal-sequenċarju tal-ġenerazzjoni tiegħu attwali li jistgħu jirrisultaw f’approċċijiet aktar inovanti għal iż-żrieda tal-espressjoni tal-ġeni u s-sitwazzjonijiet funzjonali.

Biex nisumma, M-MLV Reverse Transcriptase tiksterni wieħed mill-elemeenti essenziali fit-tiċċesa tal-biologija molekulari wara l-importanza li għandha għall-introduzzjoni tal-cDNA fid-dinjiet. Skont li sfidati jkunu qed jiċċekkja konstantementi, huwa wkoll ekkentru fuq l-uvjet ta' tehnoloġija ġdida li se jirrisultaw fil-miglu ta' karatteristiki tal-M-MLV reverse transcriptase, li se jossena l-ġnien dwar l-enkodifikazzjoni ġenetika u rregolazzjoni tal-bidu tagħha.