הบาท והיישומים של אנזים הפיכת-תעתוע M-MLV בביולוגיה מולקולרית

האנזימים היו מרכזיים במספר ת>[]]כימיות ביחס לתחום הדינמי של ביולוגיה מולקולרית. מ-ملו ריברס טרנסקריפטאז (M-MLV RT), שהוא אחד מאנזימי אלה, קיבל לאחרונה תשומת לב רבה מכיוון שהוא מסוגל לסינתזת cDNA מטמפלטים RNA. אנזים זה שמושג מוירוס הלوكמיה העכברי של מולוני (M-MLV), נמצא בשימוש נרחב בכיוון קローン גנים, ניתוח ביטוי ומחקרים בגנומיקה פונקציונלית ובשאיפות אחרות שנעשות על ידי מוסדות מחקר.

המבנה והפונקציה של M-MLV Reverse Transcriptase

M-MLV Reverse Transcriptase פועל כ-DNA-dependent DNA polymerase עם פעילות של RNA-dependent DNA polymerase ושל RNase H. הוא מזהה טמפלטים RNA ומבצע סינתזה של שרידים cDNA באמצעות dNTPs כתתיו. פעילות RNase H של M-MLV RT מבטיחה את התפורקות של הטמפלט RNA לאחר סינתזת cDNA, מה שמביא לייצור cDNA חד-שרירי.

יישומים של M-MLV Reverse Transcriptase

סינתזה של cDNA: שיטות היפוך טרנסקריפציה המשתמשות ב-M-MLV RT הן תהליכים נפוצים לשינוי תכולת RNA ל-cDNAs. עבור מחקרים בהמשך כולל PCR כמותי, ניתוח ביטוי גנים או בניית ספרייה של cDNA, הטכניקה זו היא בלתי נמנעת.

שיבוש גנים: על ידי שימוש ב-M-MLV RT, חוקרים יכולים לשכפל גנים ספציפיים ממדליות RNA שלהם. כתוצאה מכך, ניתן להפריד ולהגדיל גנים מסוימים כך שהם יוכלו להיבחן בהמשך במונחים של פונקציה.

ניתוח ביטוי: שלב חיוני בכל שיטות ניתוח הביטוי כמו qPCR או ניתוח מיקרו-מערך כולל סינתזת cDNAs באמצעות האנזים ופעילות RNase H שלו. באמצעות שיטות אלו מקבלים המדענים את ההזדמנותה להכיר כיצד הגנים מביעים את עצמם בצורה שונה במדליות ביולוגיות, מה שמציע אינטראפרטציה של רגולציה ופונקציה של הגנים.

גנומיקה פונקציונלית: בגנומיקה פונקציונלית, ה-M-MLV RT נוצל כדי הכנת ספריות cDNA מאוכלוסיות RNA מורכבות. הספריות הללו מסתכלות אחר כך על גנים עם פונקציות או פנוטיפים מסוימים, מה שמגלה תובנות חדשות על פונקציית הגן וההתקשרות שלו.

יתרונות והיקשים

ל-Trascriptase הפוך M-MLV יש מספר יתרונות כמו יעילות גבוהה, ספציפיות וניתנות לשחזור. עם זאת, יש לשים לב כי האנזים עובד היטב בתנאים מסוימים כמו טמפרטורה אופטימלית, ערכי pH וכן ריכוז מלח. לפעמים במהלך סינתזה של cDNA קיימת התפרקות של תבנית RNA כתוצאה מהפעילות RNase H של M-MLV RT, מה שמשפיע על הכמות והאיכות של cDNA הנוצר.

לסיכום, M-MLV Reverse Transcriptase היא כלים מועיל במחקר ביולוגיה מולקולרית כדי לבנות cDNA מרובעים RNA עבור מגוון יישומים. חקירת קローンת גנים, אנליזת ביטוי ומחקרים בגנומיקה פונקציונלית תלוים בצורה כבדה על M-MLV RT מכיוון שהיא מחזיקה גם את פעילות ה-RNA-DEPENDENT DNA POLYMERASE וגם את פעילות ה-RNase H; אלו הן תכונות ייחודיות בין שאר ה-Reverse Transcriptases. עם זה בראש לגבי דרישות פעילות האנזים והמגבלות הקשורות לו, חוקרים יכולים להשתמש בכוח של M-MLV RT כדי להבין את פונקציית הגן והרגולציה שלו ברמה המולקולרית.