Πολυ Α Πολυμεράση Στις Ετοιμασίες Επόμενης Γενιάς Διατυπώσεων (NGS)

poly a polymerase (PAP) είναι μια βασική ενζυματική δράση που είναι υπεύθυνη για την προσθήκη της πολυ-Α ουράς στο 3’ άκρο των μορίων RNA. Αυτή η δραστηριότητα έχει σημαντικό ρόλο στη συνολική σταθερότητα, μεταφορά και μετάφραση του RNA. Στο πλαίσιο του NGS, ωστόσο, το PAP επιτρέπει την προσθήκη του ολιγο-Α στα δείγματα RNA πριν από την αλληλούχιση, έτσι ώστε να μπορούν να αποκτηθούν δεδομένα υψηλής ποιότητας από διάφορες πηγές RNA.

Η Σημασία της Προσθήκης Πολυ Α Ουράς

Υπάρχουν πολλά πλεονεκτήματα που συνδέονται με την ενσωμάτωση της πολυ Α ουράς στο mRNA. Πρώτα απ' όλα, η ουρά Α βοηθά στην ενίσχυση της σταθερότητας των μορίων RNA απέναντι στη δραστηριότητα των ριβονουκλεασών από τις εξωνουκλεάσες. Δεύτερον, η πολυ Α ουρά έχει ρόλο στην έναρξη της μετάφρασης μέσω της προώθησης της προσκόλλησης του ριβοσώματος στο mRNA. Στην περίπτωση των προετοιμασιών NGS, το mRNA με πολυ Α ουρά μπορεί εύκολα να χρησιμοποιηθεί για πιο στοχευμένη ανάλυση γονιδιακής έκφρασης μαζί με παραλλαγές μεταγραφής καθώς μπορούν να εμπλουτιστούν συγκεκριμένα.

Προετοιμασία δειγμάτων NGS

Οι ροές εργασίας NGS περιλαμβάνουν την προετοιμασία των δειγμάτων RNA που περιλαμβάνουν τα εξής βήματα: αντίστροφη μεταγραφή, κατασκευή cDNA και ενίσχυση. Είναι επίσης κοινό να προστίθεται πολυ Α πολυμεράση κατά τη διάρκεια της σύνθεσης cDNA προκειμένου να συμπεριληφθεί μια ουρά πολυ-Α στα τελικά μόρια cDNA. Αυτή η τροποποίηση είναι κρίσιμη για την ενίσχυση και την αλληλούχιση της βιβλιοθήκης, καθώς αυξάνει την αποδοτικότητα των βημάτων που εμπλέκονται στην προετοιμασία των βιβλιοθηκών.

Εφαρμογές στην RNA-Seq

Η PAP είναι επίσης πολύ χρήσιμη σε εφαρμογές αλληλούχισης RNA (RNA-Seq) επειδή επιτρέπει πιο αποδοτική εμπλουτισμένη για mRNA με ουρά πολυ Α. Αυτό βοηθά στη σύλληψη μιας πιο καθαρής εικόνας σε επίπεδο μεταγραφώματος του οργανισμού υπό μελέτη. Έτσι, αυτή η ενίσχυση μπορεί να βοηθήσει στον προσδιορισμό διαφοροποιημένα εκφρασμένων γονιδίων, εναλλακτικών γεγονότων splicing ή ακόμη και μη κωδικών RNAs. Επιπλέον, η συμπερίληψη της PAP στις προετοιμασίες NGS επιτρέπει την απόκτηση πιο υποσχόμενων δεδομένων.

Η προσθήκη του PAP στις προετοιμασίες NGS μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την ποιότητα και την ακρίβεια των δεδομένων αλληλούχισης. Το πιο σημαντικό είναι ότι, καθώς η έρευνα συνεχίζει να προχωρά, η σημασία του PAP για την επιτρεπτικότητα των επιστημόνων να εξετάσουν το μεταγραφωμικό θα παραμείνει σημαντική.