Poly-A-Polymerase in Sequenzierungspräparaten der nächsten Generation (ngs)

Poly-a-Polymerase(PAP) ist eine Schlüssel-Enzymaktivität, die dafür verantwortlich ist, den Poly-A-Schwanz an das 3'-Ende von RNA-Molekülen anzufügen. Diese Aktivität spielt eine bedeutende Rolle für die allgemeine Stabilität, den Transport und die Translation von RNA. Im Rahmen von NGS ermöglicht PAP jedoch die Hinzufügung des A-Oligos zu den RNA-Proben vor der Sequenzierung, sodass Daten von hoher Qualität aus verschiedenen RNA-Quellen gewonnen werden können.

Die Bedeutung der Hinzufügung von Poly A Tailing

Es gibt viele Vorteile, die mit der Einbeziehung des Poly-A-Schwanzes in mRNA verbunden sind. Zunächst einmal trägt ein Schwanz zur Verbesserung der Stabilität von RNA-Molekülen gegenüber der Aktivität von Ribonukleasen durch Exonukleasen bei. Zweitens spielt der Poly-A-Schwanz eine Rolle beim Übersetzungsbeginn, indem er die Bindung des Ribosoms an die mRNA fördert. Im Fall von NGS-Vorbereitungen kann mRNA mit Poly-A-Schwanz leicht für eine gezieltere Analyse der Genexpression sowie für Transkriptvariationen verwendet werden, da sie spezifisch angereichert werden kann.

 NGS-Probenvorbereitung

Die NGS-Workflows umfassen die Vorbereitung der RNA-Proben, die die folgenden Schritte beinhalten: Reverse Transkription, cDNA-Konstruktion und Amplifikation. Es ist auch üblich, während der cDNA-Synthese Poly A-Polymerase hinzuzufügen, um einen Poly-A-Schwanz in den endgültigen cDNA-Molekülen einzuschließen. Diese Modifikation ist entscheidend für die Bibliotheksamplifikation und Sequenzierung, da sie die Effizienz der Schritte erhöht, die an der Vorbereitung der Bibliotheken beteiligt sind.

Anwendungen in RNA-Seq

PAP ist auch sehr nützlich in RNA-Sequenzierungsanwendungen (RNA-Seq), da es eine effizientere Anreicherung für poly-A-besetzte mRNA ermöglicht. Dies hilft, ein klareres Transkriptom-Bild des untersuchten Organismus zu erfassen. Solch eine Verbesserung kann somit helfen, differentiell exprimierte Gene, alternative Spleißereignisse oder sogar nicht-kodierende RNAs zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Einbeziehung von PAP in NGS-Vorbereitungen, vielversprechendere Daten zu erhalten.

Die Hinzufügung von PAP in NGS-Vorbereitungen kann die Qualität und Genauigkeit der Sequenzierungsdaten erheblich verbessern. Was noch wichtiger ist, während die Forschung weiterhin voranschreitet, wird die Bedeutung von PAP für die Ermöglichung von Wissenschaftlern, das Transkriptom zu untersuchen, weiterhin groß bleiben.